James Wesley Marsters voit le jour le 20 Août 1962 à Greenville (Californie) et a grandi dans la ville de Modesto. Très vite, il a su qu'il deviendrait acteur, notamment en participant à une adaptation de Winnie l'Ourson à l'école primaire. Après avoir fini ses études scolaires à la Davis High School de Modesto, il est accepté à la célèbre école Juilliard de New York où il reçoit une éducation de comédien classique et sa fameuse cicatrice au sourcil gauche.
En parallèle, il intègre le Conservatoire du Théâtre Américain et débute naturellement dans les oeuvres de Shakespeare Troilus et Cressida et la Douzième Nuit. Puis, on le retrouve au Théâtre Goodman de Chicago dans la Tempête ou dans la pièce Camino Real de Tennessee Williams.
Il fait ses début à l'écran en 1990 dans la série Northern Exposure, puis retourne à sa carrière théâtrale pendant 5 ans. Il participe en 1995 à Medicine Ball, en 1996 à Moloney et à Millenium en 1999. Sur grand écran, il a rejoint Famke (X-men) Janssen et Geoffrey (Shine) Rush dans la Maison de l'Horreur (W.Malone -1999). On le retrouve au côté de Andy Hallett dans la mini-série the Enforcers en 2001 et Chance d'Amber Benson en 2002.
Il a ensuite auditionné pour le rôle de Spike pour la série Buffy Contre Les Vampires, personnage qui apparaît à partir de la deuxième saison et que l'on revoit dans la troisième (1 épisode) et dans la quatrième en personnage régulier ainsi que dans 1 épisode de la série Angel.
Dans la série, il prend un accent British because le réalisateur à trouver cela très sexy. Ainsi James demande des conseils à Anthony Head (Giles)...
James est naturellement châtain donc pour interpréter Spike, il doit faire de longues séances de décoloration douloureuses...
Sa cicatrice au sourcil est accentuée au maquillage pour la série, histoire de lui donner un air "mauvais garçon". Cette dernière est appelée Le Scorpion car elle en prend un peu la forme.
Adolescent, loin d'être un enfant modèle, il aimait bien pénétrer par effraction la nuit dans les églises...
Il a un frère est une soeur ainée (Paul et Susan). Il aime jouer de la guitare, chanter, peindre et le football américain.